خرید نهال

روش‌های اصلاح مرکبات

گیاهان انتخاب شده از یک جمعیت، مبنای ارقام جدید را تشکیل می‌دهند. پس از آنکه رقم جدید تولید شد، رفتار اصلاحی یا ژنوتیپ گیاه به دست آمده مهم نیست زیرا در تکثیر آن از روش جنسی استفاده نمی‌شود. چنین گیاهانی ممکن است از طریق ارزیابی منابع ژنتیکی گیاه (مانند ژرم پلاسم یک رقم شناخته شده‌ی قدیمی)، گزینش از جمعیتی که حاصل تلاقی ارقام مختلف و یا از نتاج بذرها یا جوانه های جهش یافته هستند، به دست آمده باشد. تنوع ژنتیکی در یک جمعیت، برای قابل اجرا بودن هر برنامه‌ی اصلاحی ضروری است زیرا در تمام شیوه‌های اصلاحی از تنوع ژنتیکی برای رسیدن به اهداف اصلاحی و ارتقای وضعیت ارقام استفاده می‌شود. در اصلاح مرکبات چهار شیوه‌ی اصلی وجود دارد که عبارتند از:

معرفی گیاه (introduction) (وارد کردن گیاه)، انتخاب (Selection) (گزینش)، دورگ‌گیری و اصلاح از طریق جهش. علاوه بر این ها امروزه تکنیک‌های اصلاحی جدیدتری در اختیار به نژادگران قرار دارد که به طور قطع در برنامه‌های اصلاحی آینده، نقش مهمی خواهند داشت. در حال حاضر به خاطر وجود تولید جنین‌های رویشی، عقیمی گرده یا تخمک، خود‌ناسازگاری و دگر ناسازگاری و طولانی بودن دوره‌ی نونهالی از تکنیک‌های اصلاحی جدید چندان استفاده نمی‌شود. تکنیک‌های اصلاحی جدیدتر عبارتند از: ریز ازدیادی و ایجاد تنوع سوماکلونال (Somaclonal variation) ، دستکاری سطح پلوئیدی سلول ها، ایجاد جهش در شرایط درون شیشه‌ای (nitro mutagenesis) ، کشت بساک و تخمک، کشت جنین و نجات جنین، دورگ گیری سوماتیکی یا امتزاج پروتوپلاستی، تولید گیاهان عاری از ویروس، تراریختی ژنتیکی، نشانگرهای مولکولی و غيره.

معرفی گیاه

جمع آوری ژرم پلاسم از منابع خارجی، روش مهمی در اصلاح مرکبات است. در این شیوه‌ی اصلاح، ارقام جدیدی که ویژگی‌های مطلوب و دلخواه را دارند، به طور مستقیم از کشورها یا مناطق دیگر وارد می‌شوند. این روش عمدتاً باعث پراکنش میوه‌های مرکبات در سراسر جهان شده است. ممکن است گیاهان وارد شده، به عنوان رقم قابل کشت مورد استفاده قرار بگیرند یا در برنامه‌های اصلاحی آینده، برای بهبود ارقام محلی یا ارقام موجود، از آنها استفاده کرد. این گیاهان اصلاح شده قطعاً باعث کاهش اثرات سوء ناشی از تک کشتی در نواحی بزرگتر می‌شود. از جنس‌های مختلف خانواده‌ی مرکبات مانند Poncirus، Severinia، Eremocitrus و غیره می‌توان در برنامه‌های اصلاحی که با هدف افزایش مقاومت در برابر بیماری‌ها یا غلبه بر مشکلات خاکی و آبی مانند شوری، استفاده کرد. این امر یقیناً موجب تداوم تولید مرکبات خواهد شد. به عنوان مثال نارنگی کلئوپاترا تا حد زیادی نسبت به شوری مقاوم است یا پونسیروس در مقابل پوسیدگی فایتوفترایی طوقه و ریشه، نماند مرکبات و ویروس تریستزا مقاوم است. علاوه براین، یکی از نژادهای پونسیروس به نام فلائینگ دراگون (Flying Dragon)  دارای ژن پاکوتاهی است که موجب کاهش ارتفاع و حجم تاج درختان پیوندی می‌شود و عملیات داشت و برداشت را تسهیل می نماید.

 انتخاب (گزینش)

در این شیوه، ارقام برتر را از میان تنوع طبیعی موجود در باغ‌ها انتخاب می‌کنند. این عمل شامل بررسی دقیق ژرم پلاسم موجود در نواحی مختلف و کلکسیون ها و ارزیابی آنها در محیط مورد نظر (هدف) و سپس انتخاب افراد مطلوب است. در این روش، برای موفقیت بیشتر لازم است مقدار ژرم پلاسم جمع آوری شده فراوان باشد زیرا هر ژنوتیپ در صورت از دست رفتن، قابل بازگشت و دسترسی مجدد نیست. اگر مقصود از کار اصلاحی ارتقای میزان تحمل در مقابل تنش های محیطی است، لازم است ژرم پلاسم را از موطن طبیعی گیاه که آن عامل تنش‌زا را در خود دارد، جمع آوری نمود. زیرا مرکبات در محل رویش در کنار تنش های زنده و غیرزنده طبیعی موجود تکامل یافته‌اند و در آنها احتمالا منابعی را می‌توان یافت که در مناطق دیگر هم در برابر تنش های زنده و غیرزنده مقاومت دارند.

در انتخاب، برای رسیدن به صفاتی که توارث پذیری بالا دارند، مانند ارتفاع، تعداد روزهای لازم تا گل‌دهی، رنگ میوه، مقاومت در مقابل بیماری و غیره، گزینش گیاهان منفرد کافی و مؤثر است اما برای رسیدن به صفاتی مانند عملکرد، ارزیابی آزمایشات تکراردار در محیط مورد نظر لازم است. بررسی باغ هایی که به فراموشی سپرده شده‌اند، برای پایدار نمودن تولید، مهم است. گیاهان باردهنده‌ای که در این شرایط انتخاب می‌شوند، نمونه‌های بسیار مناسبی برای شرایط حداقل استفاده از کود و آفت‌کشها هستند. چنین گیاهانی را معمولا در باغ‌های قدیمی می‌توان یافت و برگزید. بدیهی است که اگر گیاه مطلوبی یافت شود می‌توان با صرف حداقل مخارج، آن را تکثیر و به عنوان رقمی جدید معرفی کرد.

دورگ‌گیری

دورگ‌گیی تلاقی کنترل‌شده‌ی دو والد که از نظر ژنتیکی با هم فرق دارند، با هدف به دست اوردن رقمی مطلوب است، تغییر ساختار ژنها در ژرم پلاسم موجود موجب ایجاد ارقام جدید می‌وشد. وجود کلکسیونی از ژرم پلاسم برای هر برنامه‌ی طرح‌ریزی شده‌ی دورگ گیری ضرورت دارد، تقریباً تمام برنامه‌های اصلاح مرکبات بر فرآیندهای انتخاب والدین، دورگ‌گیری و انتخاب استوار است.

اصلاح بسیاری از ارقام پیوندک از طریق دورگ گیری و گزینش صورت می‌گیرد. برای نمونه می‌توان Kinnow، Honey، Sunburst،Robinson ،Fallgle   و بسیاری از تانگورها و تاجلوها نام برد. برای پایه‌ها نیز به طور مشابه برنامه‌های دورگ‌گیری طراحی شده‌است و به این ترتیب تعداد قابل توجهی از انواع پایه‌ها به وجود آمده است. به عنوان مثال می توان به سیترنج های Carrizo، Troyer، Rusk، C-32، C-35، Benton، Willits، سوئینگل سیتروملو، 639-X، رانگ پورلایم × ترویر سیترنج (دورگی پاکوتاه)، Trifeola، راف‌لمون × نارنگی (Shekwasha) و غیره اشاره کرد.

برای دور‌گ گیری باید از ژنوتیپ‌های مختلفی که صفات مطلوبی دارند، استفاده کرد تا اهداف ویژه مانند تولید ارقام زودرس با عملکرد بالا و کیفیت خوب میوه محقق شود. به این ترتیب پایه های اصلاح شده در مقابل تنش‌های زنده و غیرزنده، مقاومت و سازش پذیری بیشتر دارند و صفات مثبت دیگری هم در آنها وجود دارد.

از تلاقی پونسیروس و کامکوات با جنس Cirius نتاج های مانند سیترنج‌ها (پرتقال × پونسیروس)، سیتروملوها (گریپ‌فروت × پونسیروس)، سیترادیاها (نارنج × پونسیروس)، لایم کوات‌ها (کامکوات × مکزیکن لایم) و غیره حاصل شده است. دورگ‌هایی مانند تانجلوها (نارنگی × گریپ‌فروت)، لمونایم ها (لمون × لایم) و تانگور (نارنگی × پرتقال) نیز حاصل چنین تلاقی‌اند.

به طور کلی دورگ‌گیری در برنامه‌های اصلاحی پایه و پیوندک، همواره مشکلاتی را به همراه دارد که عمئتاً ناشی از دوره‌ی طولانی نونهالی نتاج است که باعث به تأخیر افتادن زمان ارزیابی می‌شود، علاوه براین، اغلب ارقام تجاری به میزان بالایی چند جنین‌اند و به همین خاطر دانهال‌های دورگ تولید شده ضعیف هستند و تشخیص تعدادی از آنها از نتاج نوسالار بسیار مشکل است. در برنامه‌های اصلاحی پیوندک چون هیچ گونه نشانگر مرفولوژیکی خاص وجود ندارد، چنین مشکلاتی بسیار بارز است. غالباً در اصلاح پایه ها پونسیروس را والد پدری درنظر می گیرند، زیرا نه تنها حامل ژن نشانگر غالب یعنی صفت سه برگچه‌ای بودن است، بلکه در برابر پوسیدگی های فایتوفترایی، نماتد مرکبات و ویروس نریستزای مرکبات نیز مقاوم است. از این رو در بین نتاج موجود، آن دسته از دانهال‌هایی که دارای برگ سه برگچه‌ای هستند همگی دورگ محسوب می‌شوند. از طرف دیگر وجود جنین نوسلار در ازدیاد غیرجنسی مرکباتی که با استفاده بذر حاصل شده‌اند، بسیار مفید است. علاوه براین، دانهال‌های نوسالار قوی، یکنواخت و عاری از بیشتر ویروس های گیاه مادری هستند. بسیاری از ارقام پوملو و نارنگی کلمانتین تک جنین‌اند و فقط دانهال های جنسی تولید می‌کنند.

در برنامه‌ دورگ گیری برای اصلاح رقم، والدینی انتخاب می شوند که صفات مکمل یکدیگر را داشته باشند. همچنین اغلب از ژنوتیپ هایی که به میزان زیادی دارای جنین جنسی هستند، به عنوان والد مادری استفاده می‌شود. جوانه‌های گل بالغ اما بازنشده‌ی روی والدی مادری در نخستین ساعات روز نرک‌کشی شده و در صبح روز بعد، پس از آن که بساک‌ها شکوفا شدند، گرده افشانی دستی انجام می‌گیرد. پس از گرده افشانی در کیسه‌ی مخصوص محبوس شده و کیسه‌ها بعد از یک هفته برداشته می‌شوند و اجازه داده می‌شود تا میوه‌ها به مرحله‌ی رسیدگی کامل خود برسند. در جایی که گل‌دهی هم زمان پایه های مادری و پدری مقدور نیست، باید گرده را تا زمان آماده شدن پایه‌ی مادری در دما و رطوبت پایین نگهداری کرد. روش‌های نگهداری دانه‌ی گرده در حال حاضر استاندارد شده‌اند. تنظیم تقویم آبیاری می‌تواند موجب همزمان شدن گل‌دهی جنس‌های Poracirus و Citrus شود.

بذرهای دورگ که در داخل میوه‌های حاصل از دورگ گیری تولید شده‌اند، پس از رسیدن کامل میوه‌ها، استخراج و سریعاً کشت می شوند. پس از سبز شدن بذرها باید دانهال های دورگ را از نوسالار جدا و انواع دورگ را در مزرعه کشت کرد. این دانهال ها تا زمان میوه دهی به رشد خود ادامه می‌دهند و برای ارزیابی مقاومت در برابر امراض مختلف، آفات حشره‌ای، نماتدها و نیز برای بررسی میزان سازگاری با پایه‌های مختلف مورد بررسی قرار می گیرند. ارزیابی دانهال های دورگ برای تعیین مقاومت در برابر بیماری‌ها و آفات ممکن است در سنین نخستین و از طریق تکثیر غیرجنسی آنها مثلاً از راه قلمه زنی انجام شود که برای این امر زمان زیادی لازم نیست. امروزه به کمک ایزوزایم و نشانگرهای مولکولی بدون استفاده از برخی نشانگرهای مرفولوژیکی، دورگ‌های حاصله از والدین را می‌توان با دقت زیادی شناسایی نمود.

پس از پیوند دانهال های دورگ روی پایه های تجاری، اندازه و قدرت درخت، عملکرد، وزن میوه، مقدار عصاره و تعداد بذر به ازای هر میوه، کل مواد جامد محلول و اسیدیته‌ی میو‌های درخت پیوندی، در چندین محل، مورد ارزیابی مجدد قرار می‌گیرد. پس از این ارزیابی، رقم پیوندک برای کشت تجارتی عرضه می شود.

برای اصلاح پایه نیز روشی تقریباً مشابهی به کار می‌رود ولی در این مورد باید حداقل یکی از والدین انتخابی به میزان بالایی نوسالار باشد تا دورگ‌ها از طریق بذر نیز قابل تکثیر شوند. در این مورد دانهال‌هایی را که در برابر اغلب بیماری‌های خاکزاد مانند پوسیدگی طوقه، نماتدها و عواملی از قبیلی شوری مقاومت بیشتری دارند، انتخاب می‌شوند. گیاهان مطلوب را انتخاب می‌کنند و برای همین نحوه‌ی رشد و نمو آن، پیوندک روی آنها را آزمایش می‌کنند و در صورتی که گیاه حاصل شده، جنین‌های نوسالار زیادی داشته و در برابر تنش‌های زنده و غیر زنده مقاوم باشد و همچنین میوه‌هایی با کیفیت مطلوب بدهد و طول عمر پیوندک روی آن نیز زیاد باشد، آن را برای کشت تجاری عرضه می نمایند.

 اصلاح از طریق جهش (Mutation breeding)

در این روش، از طریق عوامل جهش‌زا تنوع در گیاه ایجاد می‌شود. جهش جوانه‌ای که می‌تواند از نسلی به نسل دیگر منتقل شود، موجب بروز صفاتی غیرمعمول در بخش های مختلف درخت خواهد شد. چنین تنوعی که در بافت‌های رویشی گیاه ایجاد شده، جهش جوانه نامیده میشود. تنوع در جوانه، ابتدا از سلول های تغییریافته‌ی منفرد نشأت می‌گیرد و در میوه‌ها، شاخه‌ها یا گل گیاه شکل می‌گیرد. این جهش ها را می‌توان به واسطه‌ی رنگ، اندازه، شکل، بافت، میزان رشد یا خصوصیات فیزیکی دیگر شناسایی کرد. بسیاری از تنوع های یافت شده در میوه‌ی مرکبات از تغییرات میوه‌ی منحصر به فردی از یک درخت نشأت می‌گیرند. این تغییرات غالباً نامطلوب‌اند، مانند بدشکلی میوه، ویژگی‌های غیرطبیعی برگ و کاهش عملکرد، البته تعداد اندکی از این صفات نیز در موقعیت‌هایی ممکن است سودمند باشند.

آنچه در این مورد اهمیت دارد، این است که Citrus و جنس های وابسته به آن شدیداً مستعد بروز جهش های ژنتیکی هستند. اکثر ارقام پیوندک و پایه های امروزی نتیجه‌ی جهش های طبیعی درختانی هستند که در باغ های تجاری یافت می شوند.

چون جهش های طبیعی در مرکبات بسیار سودمندند، متخصصان سعی نموده‌اند به کمک عوامل جهش‌زای شیمیایی و فیزیکی در گیاه، جهش‌های مصنوعی را ایجاد نمایند. در مرکبات بذرها و جوانه‌های چوب با اشعه‌ی گاما پرتوتابی شده‌اند و مشخص شده که بذرها نسبت به پرتوتابی، تحمل بیشتری دارند. پرتوتابی روی بذر گریپ‌‌فروت رقم استار روبی (Star Ruby) نمونه‌ای از این روش است. معایب اصلی این گونه جهش ها این است که اکثریت قاطع آنها نامطلوب‌اند و جهش یافته‌های مطلوب نیز ممکن است از نظر صفات مورد نظر، پایداری لازم را نداشته باشند.

گاهی اوقات آنها اثرات شیمری ایجاد می‌کنند که جداسازی آنها بسیار مشکل است. به هر صورت تاکنون، روش اصلاح از طریق ایجاد جهش برای مرکبات ادامه داشته است.

اصلاح از طریق پلی پلوئیدی

دیپلوئیدی (۱۸ = X ۲ =n ۲) قاعده‌ی کلی جنس Citrus و جنس‌های وابسته به آن است، هرچند که تیپ‌هایی با شمارگان کروموزومی بیشتر نیز در این جنس‌ها شناسایی شده‌اند. لانگلی در سال 1925 میلادی کامکوات وحشی رقم Hongkong (Fortunella hindsii Swingle) را به عنوان یک تتراپلوئید شناسایی کرد ولی در سال ۱۹۶۷ میلادی، سوئینگل و ریس (Reece) فرم، دیپلوئید ان را گزارش کردند. متعاقب آن بسیاری از تتراپلوئیدهای خود به خودی از Citrus و poncitrus شناسایی شد. تریپلوئیدها در نتاج جنسی والدین دیپلوئید یافت می شوند و برخی از انوپلوئیدها و تعداد اندکی از افراد با سطح پلوئیدی بالاتر نیز شناسایی شده‌اند.

اغلب تتراپلوئیدهای خود به خودی به صورت دانهال هایی نوسالار، در جریان مطالعات اصلاح نباتی و بررسی ارقام به دست آمده‌اند. آنها اغلب در بذر میوه هایی که به طور عمده مولد دیپلوئیدها هستند، موجودند. این مطلب حاکی از آن است که دو برابر شدن کروموزوم‌ها در تخمک یا تخمدان انجام می‌شود. اگرچه تولید تتراپلوئیدهای نوسالار، از اغلب ارقامی که تولید دانهال‌های نوسالار می‌کنند، امکان‌پذیر است اما برخی نسبت به سایرین، نیاز به حضور دانهال‌های بیشتری دارند.

در هر حال استفاده از این تکنیک برای تولید ارقام بی‌بذر بسیار مفید است. تریپلوئیدها که به طور معمول بی‌بذر هستند، ممکن است از تلاقی یک والد تتراپلوئید با والدی دیپلوئید به دست بیاید. نتاج تریپلوئید چون تقسیم میوز ندارد، بی بذر است. رقم ملوگلد (Melgold) و گریپ‌فروت اوروبلانکو (Oroblanco) نمونه‌هایی‌اند که از طریق این تکنیک اصلاحی ایجاد شده‌اند.

بیوتکنولوژی

پیشرفتهای در بیوتکنولوژی، برخی از محدودیت‌های روش های سنتی از بین رفته است. در بیوتکنولوژی استفاده بافت برای انتخاب سوماکلونال یقیناً نقش مهمی در برنامه‌های اصلاحی در آینده خواهد داشت، زیرا تنوع سوماکلونال به صورت خود به خودی القا می‌شود یا با تغییر ترکیب محیط غذایی، می‌توان چنین تنوعی را به وجود آورد. این تنوع روش‌های اصلاح سنتی نیز به کار گرفت. در مرکبات، سوماکلونال‌ها از حیث تحمل به شوری نیز ارزیابی و گزینش می‌شوند. جهش‌زایی درون شیشه‌ای در حذف برخی نواقص خاص ارقام پایه و پیوندک نقش مهمی دارد. معمولاً کشت بسام و گرده در تولید گیاهان هاپلوئید وفقیت آمیز است. گیاهان همگون هاپلوئید به عنوان والدین در برنامه‌های اصلاحی ارزشمند هستند. استفاده‌ی دیگری که زا کشت بساک و گرده می‌وشد عبارت از تولید دیپلوئیدهای کاملاً هموزیگوس از طریق دو برابر کردن کروموزوم‌های منوپلوئیدهای تولید شده در این سیستم کشت است. از تکنیم پیوند نوک شاخساره برای تولید گیاهان عاری از بیماری‌های ویروسی استفاده می شود. جداسازی پروتوپلاست‌ها از تخمک، برگ و سایر بافت‌ها انجام شده است. دورگ‌گیری سوماتیکی یا غیرجنسی، به ویژه زمانی که تلاقی‌های جنسی بین گونه‌ای و بین جنسی ممکن نباشد، مورد استفاده قرار می‌گیرد. بسیاری از محققان دورگ‌های سوماتیکی را از طریق امتزاج پروتوپلاست‌های ارقام و گونه‌های مرکبات به وجود آورده‌اند. چنین دورگ‌هایی ممکن است از گونه‌های ناسازگار جنسی ایجاد شوند. این روش به ویژه در انتقال ژن مقاوم در برابر تنش‌های زنده و غیر زنده از گونه‌های وابسته، مفید است. نجاتت جنین (Embryo rescue)، تکنیکی است که از ان برای تجدید حیات جنین‌های تریپلوئید حاصل از تلاقی والدین دیپلوئید و تتراپلوئید، می توان استفاده کرد. دیپلوئید مورد استفاده در این تلاقی باید تک جنین باشد. جنین‌هایی که به خودی خود نمی‌توانند زنده بمانند کمک مؤثری بع اصلاح مرکبات می کنند. استفاده از این تکنیک در برخی از تلاقی ها به صورت امری معمول و عادی درآمده است.

تجزیه‌ی آیزورایم برای شناسایی دانهال‌های جنسی و نوسلار روشی سودمند است. تجزیه‌ی (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)) RFLP روی DNA هسته که به تعداد کم یا زیاد کپی‌برداری شده باشد، می‌تواند برای تشخیص دانهال های جنسی از غیرجنسی در محیط درون‌شیشه‌ای به کار برده شود. در برنامه‌های اصلاحی بعد از دورگ‌گیری، هیبریدها را می‌توان با استفاده از نشانگرهای ملکولی مانند Simple Sequence Repeats (SSR) SSR، ISSR(Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)و Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD))RAPD به گروه‌های مجزایی تفکیک کرد. از شیوه‌ی RFLP می‌توان برای اصلاح نقشه‌های ژنوم مرکبات استفاده کرد. چنین نقشه‌هایی ممکن است در مکان یابی ژن هایی که اثر یا اثراتی خاص دارند، مهم باشند. ژن های نشانگر روی کروموزوم های ویژه‌ای شناسایی شده‌اند، برخی از آن ها با ژن‌های مقاوم در برابر بیماری یا سرما، مرتبط شده‌اند. تجزیه‌ی SSR و RAPD برای ارزیابی چندشکلی و تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپ‌های ارقام مختلف مرکبات و تشخیص دورگ‌های سوماتیکی می تواند مورد استفاده قرار بگیرد. از انگشت نگاری DNA برای تشخیص و آزمون والد مرکبات استفاده می‌کنند. با تعیین نقشه‌ی این نشانگرها می‌توان به چگونگی توارث این ژن‌های ویژه که ارتباط نزدیکی با آنها دارند، پی برد. بنابراین هدف غایی عبارت از تعیین محل استقرار ژن‌ها با استفاده از تکنیک‌های مولکولی و سپس استفاده از این اطلاعات برای تشخیص دورگ‌های دارای ژن‌های مطلوب و مورد نظر و نیز حذف دورگ‌های ناخواسته است که ژن‌های مذکور را ندارند. چنین سیستمی تا حدودی نیاز به انجام دورگ گیری‌های فراوان و ردیابی تعداد زیادی از دورگ‌های حاصل شده به منظور تشخیص ویژگی‌های مطلوب آنها دارد. با استفاده از نشانگرهای ملکولی برای معلوم کردن ارتباط فیلوژنتیک موجود در درون جنس Citrus و جنس‌های وابسته‌ی خانواده ی Rutaceaea استفاده شده و معلوم شده که برخی از تشخیص های قبلی مربوط به گونه های مرکبات غلط بوده است. کوشش‌هایی در همین اواخر برای دستیابی به نوترکیبی ژنتیکی گونه‌ها و ارقام مرکبات از طریق بمباران ذره‌ای یا تکنیکی که با واسطه‌گری اگروباکتریوم قابل اجراست، صورت گرفته است. از ژن Bt در گیاه پنبه برای کنترل آفات استفاده شده است، بدون شک انتقال این ژن به مرکبات باعث پایداری تولید در مرکبات خواهد شد.